银杏叶_银杏叶总黄酮的微波提取及纯化工艺的创新机制4900字

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银杏叶总黄酮的微波提取及纯化工艺的创新机制4900字

银杏叶总黄酮的微波提取及纯化工艺的创新机制4900字 银杏(Ginkgo biloba L.)原产我国,系侏罗纪的孑遗植物,别名“活化石”。

银杏的叶、果、树皮均有一定的药理作用,其中叶的药用价值最高。银杏叶提取 物主要含有黄酮类和银杏内酯类,银杏黄酮在提取物中的含量较高其中所含有的 黄酮能够增加脑血管流量,改善脑血管循环功能,保护脑细胞,扩张冠状动脉, 防止心绞痛及心肌梗塞,防止血栓形成,提高机体免疫能力。对冠心病、心绞痛、 脑动脉硬化、老年性痴呆、高血压病人均十分有益。以银杏叶提取物为主要成分 多种制剂已广泛应用于临床[1]。因此银杏叶黄酮的安全、优化的提取具有实际 应用意义。

提取制备方法较常见的有煎煮法、溶剂萃取法和CO2超临界流体萃取法等。

煎煮法直接加热容易破坏黄酮结构,溶剂萃取法耗费大量溶剂,对环境污染较高, CO2超临界流体萃取法对设备要求较高[2-3]。本研究主要以黄酮含量作为指标, 利用正交设计考察微波法提取的最佳工艺条件[4],并对初提物进一步通过大孔 树脂分离纯化,考察其最佳纯化条件[5-6]。

1 实验材料、试剂及仪器 1.1 材料与试剂 银杏叶,D101型大孔树脂、AB-8 型大孔树脂、HPD400型大孔树脂。

芦丁标准品(批号:100080-200306中国药品生物制品鉴定所),5%亚硝酸 钠、1%氢氧化铝、4%氢氧化钠、50%乙醇溶液、60%乙醇溶液、70%乙醇溶液、80% 乙醇溶液。

1.2 仪器和设备 DG 120型四两装中药材粉碎机(浙江省瑞安市春海药材器械厂)、M700型微 波炉(广东美的微波炉制造有限公司)、GL-21M型高速冷冻离心机(长沙湘麓仪 器有限公司)、YP202N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)、722型紫外可 见分光光度计(上海光谱仪有限公司)。

2 实验方法2.1 芦丁的标准曲线 精密称取一定量的芦丁标准品,加60%乙醇制成0.2 mg/mL标准品溶液。准确 吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL芦丁标准溶液,放入已标好号的1~6号10 mL 容量瓶内,分别加入2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0 mL的60%乙醇溶液;
再加入5% 亚硝酸钠溶液0.5 ml摇匀,放置6 min;
加入10%硝酸铝溶液0.5 mL,放置6 min 后;
加入4%氢氧化钠溶液4.0 mL,加60%乙醇定容,摇匀后,放置15 min;
在510 nm处测定吸光度。用1号容量瓶作为空白,用芦丁浓度作为横坐标、吸光度作为 纵坐标绘制标准曲线。

2.2 银杏叶黄酮的提取工艺的优化 2.2.1 银杏叶中总黄酮的提取工艺流程 市售干燥的银杏叶用粉碎机粉碎。精密称取1 g的银杏叶粉末于烧杯中,加 入一定体积的60%乙醇,在微波低火档处理一定时间,提取1~3次,纱布粗过滤 后,6000 rpm离心15 min,上清液减压抽滤,即得银杏叶提取液。

2.2.2 提取液中黄酮含量的测定 精密量取上清液1 mL,加至25 mL容量瓶中,再加入5%亚硝酸钠溶液0.5 ml 摇匀,放置6 min;
加入10%硝酸铝溶液0.5 ml,放置6 min后;
加入4%氢氧化钠 溶液4.0 ml,加60%乙醇定容,摇匀后,放置15 min;
定容至刻度,510 nm测定 吸光度,带入回归方程求得黄酮浓度。按照以下公式计算总黄酮提取率:
银杏叶总黄酮含量=浓度(mg/ml)×稀释倍数×提取液体积(ml)×10-3/ 原料干重(g)。

2.3 大孔树脂分离纯化银杏叶黄酮 2.3.1 大孔树脂的预处理 将大孔树脂用乙醇浸泡24 h,倒去上层乙醇然后装柱,洗至流出液加水不呈 白色浑浊为止,以去除树脂中所含有的低聚物、添加剂等杂质。

2.3.2 大孔树脂的静态吸附实验 2.3.2.1 大孔树脂类型的选择 大孔树脂在黄酮的分离纯化中应用较多,而树脂的厂家和型号众多,本实验选取较常用的三种大孔树脂D101型、AB-8型和HPD400型,分别考察其比吸附量和 解吸率。

2.3.2.2 比吸附量的考察 分别取按2.3.1方法预处理好的三种大孔树脂1g置50 mL带塞锥形瓶中,精密 称取银杏叶初提液20 mL,在振荡器中震荡24 h,待其饱和后测得其比吸附量。

P=(Cm-Cn)V/W 其中,P为比吸附量(mg/g),Co为起始质量浓度(1 g/L),Ct为上清液的 质量浓度(1 g/L),V为溶液体积(mL),W为树脂质量(g)。

2.3.2.3 大孔树脂解吸率的测定 按2.3.2.2的方法将充分吸附后的树脂加入70%乙醇30 mL振荡器中震荡12 h 后,过滤,精密量取2 mL滤液测定黄酮含量,按如下公式计算解吸率。

解析率=洗脱液总黄酮浓度×洗脱液体积/(比吸附量×树脂质量) 2.3.3 大孔树脂纯化银杏黄酮的工艺考察 2.3.3.1 乙醇洗脱浓度的考察 取银杏提取液8 mL,共分成4份,分别加入到装有10 g大孔树脂的层析柱中, 吸附流速为2倍柱体积/h,再以两倍柱体积/h的水洗脱,弃去水洗液,然后分别 以60%、70%、80%、90%乙醇洗脱,分别收集乙醇洗脱液至200 mL,合并乙醇洗脱 液,测定吸光度,计算总黄酮含量及解吸率。精密吸取洗脱液50 mL,旋转蒸发 器浓缩后,真空干燥箱中充分干燥,得干浸膏质量。计算干浸膏中黄酮含量。

2.3.3.2 洗脱剂流速的考察 取银杏提取液6 mL,共分成3份,分别加入到装有10g大孔树脂的层析柱中, 吸附流速分别为1倍柱体积/h、2倍柱体积/h、3倍柱体积/h,再以两倍柱体积/h 的水洗脱,弃去水洗液,然后以80%乙醇洗脱,分别收集乙醇洗脱液至200 mL, 合并乙醇洗脱液,测定吸光度,计算解吸率。

2.3.3.3 洗脱剂用量的考察 取银杏提取液8 mL,共分成4份,分别加入到装有10 g大孔树脂的层析柱中, 吸附流速为2倍柱体积/h,再以两倍柱体积/h的水洗脱,弃去水洗液,然后以80%乙醇洗脱,每隔3 min对流出液检验,至没有黄酮反应为止,记录乙醇用量[10]。

2.3.4 大孔树脂洗脱液中黄酮的含量测定及得率计算 精密吸取洗脱液200 mL,旋转蒸发仪初步干燥,然后置于真空干燥箱中充分 干燥,得干浸膏质量。称取一定量少量干浸膏,无水乙醇溶解,测定其中黄酮含 量,以求得干浸膏中黄酮含量。

3 实验结果 3.1 芦丁的标准曲线 在510 nm下测定溶液的吸光度,以不同浓度芦丁溶液为横坐标,吸光度为纵 坐标绘制标准曲线(如图1),线性方程为y=10.435x,R2=0.9993。

3.2 银杏叶黄酮提取的正交试验结果 根据前期单因素实验结果,确定影响总黄酮提取效率的4个主要因素:溶剂 浓度(A)、料 液比(B)、提取次数(C)、提取时间(D),因素水平表见表1,进行L9 (34)的正交试验。

由表2可知:1)直观分析结果表明,各因素极差值的高低影响银杏叶中黄酮 提取工艺因素大小依次为乙醇浓度>料液比>提取次数>提取时间,最佳工艺条件 为A2B2C2D1,即乙醇浓度60%、料液比1:30、提取2次、每次提取时间3 min。在 此条件下再进行验证试验,平均得率2.161%。在最佳工艺下提取银杏叶黄酮用于 后续纯化,计算结果如下:
提取液中黄酮含量=样品浓度×样品体积×稀释倍数=0.4325 g;

干浸膏重量=2.532 g 干浸膏中黄酮含量=提取液中黄酮含量/干浸膏重量×100%=17.08% 3.3 大孔树脂最佳纯化工艺的考察 3.3.1 大孔树脂的静态吸附实验 3.3.1.1比吸附量的考察 三种大孔树脂对银杏黄酮的比吸附量见表3。

3.3.1.2 大孔树脂解析率的测定3种大孔树脂对银杏黄酮的解析率见表4。

由表3和表4可知,三种大孔树脂对银杏黄酮的比吸附量D101型�HPD400型 �AB-8型,对银杏黄酮的解析率D101型�HPD400型�AB-8型,因此在三种树脂中 选定D101型大孔树脂作为纯化银杏叶中黄酮的树脂,考察乙醇洗脱浓度、洗脱速 率、洗脱剂用量等因素对黄酮纯化的影响。

3.3.2 大孔树脂纯化银杏黄酮的工艺条件考察 3.3.2.1 乙醇洗脱浓度的考察 由表5可知,随着乙醇浓度的升高,黄酮收率略增加,但增加不明显,但解 吸率和产物浓度是80%乙醇最好,因此选择80%乙醇作为洗脱剂。

3.3.2.2 洗脱剂流速的考察 由表6可知,洗脱剂的过柱速度主要影响工作效率和黄酮的吸附率。流速增 加黄酮的吸附量下降,结合实验效率选择2BV/h合适。

3.3.2.3 洗脱剂用量的考察 以80%乙醇洗脱,每隔3 min对流出液检验,至没有黄酮反应为止,乙醇用量 约为3倍柱体积。

3.3.2.4 最佳工艺的实验 取银杏提取液2 mL,上样到装有10 g大孔树脂的层析柱中,吸附流速为2倍 柱体积/h,再以2倍柱体积/h的水洗脱,弃去水洗液,然后以80%乙醇洗脱,收集 乙醇洗脱液至180 mL,合并乙醇洗脱液,测定吸光度,计算总黄酮含量。精密吸 取洗脱液150 mL,旋转蒸发仪初步干燥,然后置于真空干燥箱中充分干燥,得干 浸膏质量。计算纯化后的干浸膏中黄酮得率。

150 mL提取液中黄酮含量=样品浓度×样品体积×稀释倍数=0.0451 g 干浸膏重量=0.1021 g 干浸膏中黄酮得率=提取液中黄酮含量/干浸膏重量×100%=44.17% 4 结语 为了确定银杏叶总黄酮用微波提取的最佳工艺,采用正交设计法对溶剂浓度、 料液比、提取时间和提取次数4个因素进行考察,确定其对银杏叶总黄酮提取率的影响,由正交试验得出的优化工艺条件为乙醇浓度60%、料液比1∶20、提取2 次、微波低档作用3 min,在此条件下,黄酮提取率为2.161%。理论上来说,提 取次数越多,黄酮的提取效果越好。但是,单因素试验中提取次数的结果表明提 取两次时的效果最好,原因可能是因为提取次数进行到三次以上后,微波温度偏 高,破坏了黄酮结构,黄酮提取率反而越低。

另外,以银杏叶黄酮含量的指标确定了大孔树脂纯化的最佳工艺参数,结论 如下:(1)D101型、AB-8型、HPD400型大孔树脂中选用D101型作为纯化树脂;

(2)通过实验筛选,以80%乙醇、2倍柱体积/h的流速洗脱、收集乙醇洗脱液至3 倍柱体积,为最佳工艺。(3)经大孔树脂分离纯化后,黄酮含量由17.08%提高 到44.17%,即经过纯化提取后黄酮的含量明显提升。在本研究过程中,银杏叶黄 酮提取纯化所用溶剂仅有生物安全性较好的乙醇和水,没有其他有机溶剂及试剂 的引入,适合应用于制药领域,因此本研究为银杏叶黄酮工业化的提取及生产提 供了一定的参考和依据。

[1]范莹莹,黄小凤.乙醇-水体系中黄酮类化合物的浸取工艺研究[J].昆明 理工大学学报(理工版),2006,31(2):104-106. [2]朱平华.银杏叶黄酮类化合物的提取工艺研究[J].化工生产与技术,2006, 13(6):25-27. [3]陈礼明,刘圣,唐丽琴,等.正交试验优选黄连散中葛根等成分的提取工 艺[J].中国药房,2006,17(6):415-417. [4]张志红,黄毅.银杏叶提取物中黄酮类化合物的分光光度分析研究[J]. 分析实验室,2005,24(6):17-19. [5]徐海南.大孔吸附树脂纯化射干总异黄酮的工艺考察[J].中国学杂志, 2007,27(5):607-609.

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